В медико-биологических исследованиях метод
абсолютной калибровки оказывается незаменимым лишь в редких случаях. К ним
может относиться, например, определение малых концентраций веществ в сочетании
с нерегистрируемыми детектором компонентами.
Естественно,
что при этих условиях пик основного компонента не гложет быть записан на
диаграмме полностью. Кроме того, искажение формы пика, связанное с перегрузкой
колонки, затрудняет определение его площади расчетными методами и не позволяет
воспользоваться методом нормализации.
Все
взвешивания выполнялись на аналитических весах. При этом удалось добиться
точности определения калибровочных коэффициентов порядка 2 отн.%. В тех
случаях, когда это возможно, желательно контролировать состав смеси химическими
или спектральными методами.
Экспериментальное
определение калибровочных коэффициентов может проводиться двумя основными
способами. Первый из них заключается в том, что в хроматограф вводят точно
известные количества определяемых веществ и находят зависимость площади
получающегося пика от абсолютного количества введенного в колонку вещества.
Метод
внутренней нормализации является наиболее широко распространенным методом
количественной обработки хроматограмм, однако для получения достаточно точных и
объективных данных необходимо учитывать некоторые осложняющие обстоятельства.
Ввиду
того что контур большего пика основного компонента в пределах меньшего можно
приближенно считать прямой линией, этот случай тесно связан с проблемой определения
площади пика, записанного при наличии значительного дрейфа, т. е. имеющего
наклонную нулевую линию.
Один
из самых старых методов расчета площадей не-разделившихся пиков изложен в работе
Fredericks и Brooks, предложивших считать площади частично разделившихся пиков
равными площадям фигур, получающихся при опускании перпендикуляра из точки
минимума на нулевую линию.
Недавно
опубликованные работы Б. А. Руденко, А. С. Норавяна и В. Ф. Кучерова и Б. А. Руденко (1968) содержат достаточное
обоснование способа подсчета площади не полностью уложившегося на диаграмме
срезанного пика.
При
близких концентрациях таких парных компонентов визуальное выявление их
затруднительно, в то время как резкое расхождение в процентном составе смеси,
рассчитанной двумя упомянутыми методами, служит весьма определенным указанием
на наличие неразделенной пары.
В определенных случаях избавиться от наркотической зависимости помогает медикаментозное кодирование. При кодировании в организм наркозависимого пациента вводят противоядие, которое действует длительный период. Это такой же действенный метод, как и кодирование по методу Довженко, хотя принципы лечения отличаются существенно.
Вот
почему тщательное и всестороннее изучение функционального состояния коры
надпочечников, а также других желез внутренней секреции, продуцирующих
важнейшие стероидные соединения, является чрезвычайно важным и представляет не
только научный, но и принципиальный практический интерес.
Указанные
обстоятельства стимулируют разработку и применение новых методов исследования,
таких, как масс-спектрометрия, спектроскопия и газовая хроматография. Первые
два метода связаны с необходимостью иметь весьма дорогостоящее оборудование при
значительной трудности его эксплуатации и сложности интерпретации полученных
результатов.
Помимо
перечисленных, стероидный анализ методом газо-жидкостной хроматографии возможен
и производится на фазах и некоторых
других. Приготовление набивок для хроматографических колонок целесообразно
производить по наиболее употребительной методике Horning, Moscatelli и Sweeley
(1959) или по одной из методик, описанной в первой части настоящей работы.
Разделению
сложных смесей стероидов и желчных кислот методом газовой хроматографии
посвящено исследование Bloomfield (1962), в котором изложена методика и описано
ее применение как для качественного, так и для количественного анализа этих
соединений в фекальных экстрактах.
Для
удобства ознакомления с материалом последний соответственно распределен по
основным группам стероидных соединений - кортикостероидам (преимущественно
глюкокортикоидного ряда), эстрогенам и андрогенам, а также применительно к
общим вопросам, имеющим самое непосредственное отношение к физико-химическим аспектам
обсуждаемой проблемы.
Данные,
полученные указанными авторами, являются до настоящего времени одними из
наиболее полных и интересных из числа опубликованных в зарубежной литературе и
содержат сведения по всем основным этапам определения стероидных гормонов в
биологических объектах.
Patti
с сотрудниками (1963) для отделения кортикостероидов от 17-кетостероидов и для
очистки экстрактов предпочитают пользоваться колонками с флоризилом и окисью
алюминия.
Учитывая
только что сказанное, при работе со стероидами мы поступали следующим образом.
В случае необходимости, особенно при налаживании и отработке различных
вариантов обнаруживания кортикостероидов на пластинках, УФ свет применяли
только для качественного анализа.
Далее
в обе пробирки добавляют 4,4 мл ацетатного буфера с рН 4,5 и термостатируют в
течение часа при температуре 38°. Для прекращения реакции пробирки из
термостата извлекают и в них добавляют по 5 мл глицинового буфера с 10,4, после чего ко второй пробе прибавляют
0,5 мл раствора субстрата.
